D2: ۴ دندان پس از کشیده شدن و ۴۵ دقیقه نگهداری در محیط خشک، تحت تابش لیزر قرار گرفته و بدون تابش لیزر به ساکت آلوئول، جایگذاری مجدد شدند.

پروتکل معمول با لیزر فقط به سطح دندان

شکل۲-۴: تابش لیزر به دندان
شکل ۲-۵: تابش لیزر به ساکت آلوئول
شکل ۲-۶: نحوه اسپلینت گذاری
شکل۲-۷: مراحل اسپلینت کردن با سیم و کامپوزیت
شکل۲-۸: اسپلینت نهایی
در صورت وجود تداخلات اکلوزالی، کامپوزیت اضافی توسط فرز پرداخت کامپوزیت شعله ای شکل حذف گردید. برای حیوان آنتی بیوتیک (انروفلوکساسین با دوز mg/kg10 به صورت داخل عضلانی وتتراساکلین طولانی اثر با دوز mg/kg20 به صورت عضلانی)و داروی مسکن (فلونکسین مگلومین با دوزmg/kg 5/0 به صورت عضلانی) تجویز شد و رژیم غذایی نرم نیز در طول مدت مطالعه در نظر گرفته شد. پس از ۱۰ روز مجددا حیوان بی هوش شد و اسپلینت توسط فرز پرداخت کامپوزیت برداشته شده و سپس کامپوزیت اضافه نیز پرداخت شد. در روز سی ام پس از اولین مداخله مجددا بی هوش شده و رادیوگرافی PA از نواحی مورد نظر تهیه گردید و در شناسنامه حیوان ثبت گردید(شکل ۲-۱۰).
شکل ۲-۹: بررسی اکلوژن نهایی
شکل ۲-۱۰: مقایسه های رادیوگرافیک در فواصل زمانی ۰، ۱ و ۲ ماهه
بنابراین در زمان تعیین شده روز های ۳۰ و ۶۰ پس از انجام مطالعه، حیوانات بی هوش شده و از نواحی مورد نظر نیز رادیوگرافی PA تهیه شده و در انتهای ماه دوم حیوانات وایتال پرفیوژن شدند.
وایتال پرفیوژن
تهیه مقاطع هیستولوؤیک مناسب در مطالعات حیوانی نیاز به آماده سازی کافی بافت های به دست آمده قبل از برش های هیستولوژیک دارد. ثبوت (Fixation) بافت یکی از این مراحل آماده سازی است. زمان نفوذ ماده فیکساتور به لایه های عمقی و قسمت های مرکزی بافت مورد مطالعه در جلوگیری از لیز سلولی اهمیت دارد. معمولا” ثبوت بافت ها از طریق قراردهی در فرمالین ۱۰%به مدت ۱۵-۱۰ روز صورت می‌گیرد. این زمان در موردبافتهای سخت ومتراکم مانند استخوان فکین سگ کافی نیست. افزایش زمان Fixation بافت نیز تنها باعث رسوب فرمالین در لایه های سطحی می‌گردد و میزان نفوذ آنرا در قسمت های مرکزی خصوصا” زمانی که قطعه وسیع تری از بافت برای مطالعه لازم باشد، کاهش می‌دهد. بنابر این احتمال بروز اتولیز در این بافت ها زیاد است که موجب کاهش امکان بررسی های هیستولوژیک دقیق می‌شود. هدف از روش وایتال پرفیوژن Fixation سریع بافت ها قبل از بروز هرگونه تغییرات اتولیز و نکروز بافتی پس از مرگ حیوان است. تا نمای طبیعی بافت حفظ شده و بررسی های سلولی دقیق تر و راحت تر صورت گیرد. در این روش عمل Fixation بافت در زمان حیات حیوان از طریق تزریق در عروق خونی انجام می‌گیرد.
ابتدا به منظور آرام بخشی و بیهوشی عمیق حیوان از مخاوط کتامین هیدروکلراید (mg/kg20عضلانی) و زایلازین (mg/kg 1عضلانی ) و فلونکسین مگلومین با دوزmg/kg 1 عضلانی استفاده شد و برای جلوگیری از پروسه انعقاد، تزریق داخل وریدی ml2-1/5 هپارین (U/ml 50000( انجام شد. مسیر انسیژن در سمت چپ قفسه صدری ، از محل اتصال اولین دنده با استخوان جناغ شروع و تا قسمت میانی آخری دنده به صورت مایل ادامه مییافت. این مسیرقبلاً با تزریق لیدوکائین اپی نفرین دار بی حس شده بود. پس از انجام انسیژن ، بترتیب درم، اپیدرم ، لایههای چربی، فاسیای عضلانی و عضلات سینه بریده و دندهها اکسپوز گردید. دندهها با استفاده از قیچی غضروف بر، در مسیر غضروف کوستوکندریال جوینت برش و نهایتاً فلپ با انجام برشی که بین دندههای آخر به سمت مرکز قفسه صدری صورت می‌گیرد، آزاد شد. در این زمان، قلب و کلیه عروق مربوطه به راحتی در دسترس قرار خواهند گرفت. ورید اجوف فوقانی و آئورت نزولی قطع شده و سپس قسمت ابتدایی آئورت بالا رو، بلافاصله پس از خروج از قلب و قبل از تنه براکیوسفالیک توسط پنس و یا با نخ بخیه بسته شد. با در دسترس داشتن طول بلندی از شریان آئورت نزولی، به راحتی می‌توان لوله سرم را در داخل آن فرو برد و با استفاده از نخ بخیه آنرا در جای خود ثابت نمود. با این روش، مسیر جریان مایع از آئورت نزولی به سمت شریان ساب کلاوین چپ و تنه براکیوسفالیک واز تنه براکیوسفالیک به سمت Common Carotid خواهد بود. در این زمان خون و مایعات جمع شده در قفسه صدری به راحتی توسط ساکشن تخلیه می‌گردد. جهت شستشوی کامل عروق ناحیه سر و گردن با استفاده از شریان آئورت نزولی،ml 2000-1000 محلول فرمالین سالین، انفوزیون شد و با مشاهده مایع زلال خارج شده از ورید اجوف فوقانی نسبت به شستشوی کامل عروق اطمینان حاصل شد و با مشاهده حالت جمود کامل نعشی در سر و گردن و سفید شدن کامل زبان، لب، گونه و لثه، نسبت به فیکس شدن این نواحی اطمینان حاصل گردید. فکین حیوان توسط دهان بازکن باز نگه داشته شد تا در همین حالت فیکس شود(شکل ۲-۱۱). شروع فیکس شدن بافت های سر و گردن به صورت حرکات لرزشی در عضلات این ناحیه قابل رویت است. هنگام کار تهویه کافی برای خروج بخار فرمالین از محیط برقرار بود. کلیه مخاط لب، گونه و زبان با برش هایی از زیر Mucogingival Line با حفظ پوشش لثه بر روی فک جدا گردید. با انجام این برش ها وجود فرمالین در بین بافت ها و عروق خونی دیده شد. در نهایت بلوک های فکی از کانین تا کانین از کلیه اتصالات عضلانی و مخاطی جدا شد.
شکل ۲-۱۱: وایتال پرفیوژن
مراحل آماده سازی نمونه ها
۶ دندان انسیزور قدامی‌به صورت Block section از فکین سگ ها جدا گردید. سپس بافت های نرم و سخت اضافی باقی مانده جدا شده وتا حد امکان از ضخامت نمونه ها کاسته شد. پس از آن بلوک های فکی در فرمالین ۱۰% قرار داده شدند(شکل ۲-۱۲). با انتقال نمونه ها به آزمایشگاه ، بلوک ها جهت دکلسیفیکاسیون به مدت ۲هفته در مخلوط اسید فرمیک ۱۰% قرار داده شدند و این محلول هر روز عوض می‌شد. پس از نرم شدن نمونه‌ها، ۲۴ ساعت شستشو در آب جاری و ۲۴ ساعت نگهداری در محلول سولفات سدیم ۵% به منظور جذب اسید از نمونه‌ها انجام شد. پس از انجام مراحل آبگیری، در ابتدا نمونه‌ها به مدت ۳ ساعت در الکل ۷۰ درجه قرار داده شدند و پس از آن به ترتیب ۳ ساعت در الکل ۹۰ درجه،۳ ساعت در الکل ۹۶ درجه و ۳ بار در الکل مطلق هر کدام به مدت ۶ ساعت قرار داده شدند.
شکل ۲-۱۲: تهیه بلوک فکی
مدفون سازی در پارافین
بر شهای مورد نیاز در این مطالعه از نوع طولی بود. لذا نمونه ها تحت فیکساسیون مجدد قرار گرفته و سپس آبگیری شدند. عمل شفاف سازی نمونه ها با جایگزینی الکل با گزیلول انجام شد و سپس در پارافین غوطه ور شد تا پارافین جایگزین گزیلول در بافت شود. سپس نمونه ها در قالب پارافین گذاشته شد تا برای برش آماده سازی شوند.پس از این مراحل از هر بلوک پارافینی ۳-۴ برش بافتی به ضخامت ۴ میکرون با استفاده از دستگاه میکروتوم تهیه شد و سپس بر روی لام قرار داده شد و جهت بررسی های هیستولوژیک با استفاده از روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شد.
جدول ۲-۲ :مراحل رنگ آمیزی H&E