محیط کشت فوق پس از تنظیم pH روی ۶، در اتوکلاو با دمای c◦۱۲۱ و فشار bar 2/1 به مدت ۱۵ دقیقه استریل شد.
۳-۳ خالص سازی و اندازه گیری خصوصیات سویه های مخمری
به منظور خالص سازی سویه های مخمری از پودر مخمر خشک، ابتدا ۵/۰ گرم پودر مخمر با ۵ سی سی محلول سرم فیزیولوژی استریل مخلوط شد. از مخلوط به دست آمده، رقت های متوالی تهیه و در پلیت های حاوی محیط کشت YPD Agar کشت داده شد. پلیت ها در دمای ۳۰ درجه سلسیوس به مدت ۷۲ ساعت گرمخانه گذاری شدند. کلنی های تشکیل شده با استفاده از آزمون های بیوشیمیایی مورد شناسایی قرار گرفت تا مخمر ساکارومایسز سرویزیه جداسازی و خالص شود (گلابی و همکاران، ۱۳۸۹).
۳-۳-۱ بررسی توانایی مصرف قند
برای شناسایی گونه مخمری ساکارومایسز سرویزیه، توانایی مصرف قندهای مختلف توسط کلنی های تشکیل شده مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این منظور از کلنی های تشکیل شده به لوله های آزمایش درب دار حاوی ۴ سی سی محیط کشت پایه تلقیح شد. همچنین به منظور بررسی مصرف قند مورد نظر و انجام عمل تخمیر، یک لوله دورهام برای تشخیص تولید گاز در لوله های آزمایش قرار داده شد. قندهای مورد استفاده شامل گلوکز، مالتوز، گالاکتوز، لاکتوز، فروکتوز و ساکارز بود. پس از کشت، گرمخانه گذاری در دمای ۳۰ درجه سلسیوس به مدت ۴۸ ساعت در انکوباتور انجام شد. در نهایت تخمیر قند توسط مخمر با بررسی تشکیل حباب گاز در لوله دورهام و کدورت محیط انجام شد (گلابی و همکاران، ۱۳۸۹).
۳-۳-۲ بررسی توانایی مصرف اتانول
برای بررسی توانایی مصرف اتانول و شناسایی گونه ها از محیط کشت ALP Agar[43] استفاده شد. به این صورت که ابتدا از کلنی های مورد بررسی رقت مناسب تهیه و سپس در پلیت های حاوی محیط مذکور کشت داده شد. به این ترتیب توانایی مصرف اتانول با مشاهده رشد یا عدم رشد مخمر در محیط ALP Agar، مورد بررسی قرار گرفت (گلابی و همکاران، ۱۳۸۹).
۳-۳-۳ تهیه سوسپانسیون سلولی
در شرایط استریل به کمک آنس از پلیت های تازه کشت داده شده سویه های ساکارومایز سرویزیه، از کلنی های مخمر برداشته و به لوله آزمایش حاوی سرم فیزیولوژی منتقل شد. سپس از محلول رقت تهیه شد و با کمک میکروسکوپ توسط لام هموسیتومتر شمارش گردید. سپس با توجه به تعداد شمارش شده، از سوسپانسیون اولیه، سوسپانسیون سلولی با شمارش دلخواه تهیه شد.
۳-۳-۴ بررسی میزان رشد و تکثیر مخمر
میزان رشد و تکثیر سلولی مخمرهای مورد بررسی در محیط کشت YPD Broth مورد تحقیق و ارزیابی قرار گرفت. برای این منظور سویه های مخمری در ارلن های حاوی ۳۰ سی سی محیط YPD Broth در دمای ۳۰ درجه سلسیوس و دور rpm 100 به مدت ۲۴ ساعت کشت داده شد. سپس به هر یک از ارلن ها، محیط کشت تازه اضافه شد تا با عمل رقیق سازی، دانسیته نوری محیط کشت در طول موج nm 620 به ۷/۰ تقلیل یابد. پس از آن ارلن ها مجددا به شیکرانکوباتور با دمای ۳۰ درجه سلسیوس و دور rpm 100 انتقال یافتند. دانسیته نوری هر یک از تیمارها در طول موج مذکور، با فواصل زمانی ۱۶ ساعت و تا زمان نهایی ۴۸ ساعت در سه تکرار مورد سنجش قرار گرفت (Hernandez-lopez et. al., 2006).
۳-۳-۵ اندازه گیری میزان تولید گاز دی اکسید کربن توسط مخمر
برای این منظور ابتدا ۷ سی سی آب مقطر با دمای ۳۰ درجه سلسیوس به ۳۸/۰ گرم مخمر اضافه و سپس با ۱۰ گرم آرد مخلوط شد. خمیر همگن پس از تهیه در داخل بشر قرار داده و به داخل محفظه دستگاه فشار سنج هانری – سایمون منتقل شد. دمای آب دستگاه توسط حمام آب روی ۳۰ درجه سلسیوس تنظیم شد. پس از آن در فواصل زمانی ۶۰ دقیقه درجه فشار سنج دستگاه ثبت شده و در نهایت منحنی فشار گاز دی اکسید کربن حاصل از فعالیت مخمرهای مورد بررسی تا زمان نهایی ۱۸۰ دقیقه رسم گردید (Peighambardoust et. al., 2010).
۳-۴ اندازه گیری مشخصات آرد مورد استفاده
۳-۴-۱ اندازه گیری گلوتن مرطوب
اندازه گیری گلوتن مرطوب آرد مطابق با استاندارد AACC 38-12 انجام شد. ابتدا مقدار ۱۰ گرم از نمونه آرد را وزن به درون اتاقک شستشوی دستگاه انتقال داده شد. به منظور پخش یکنواخت آرد، اتاقک شستشو را به آرامی تکان داده، سپس مقدار ۸/۴ میلی لیتر محلول کلرید سدیم ۲% به آن اضافه شد. در این جا نیز برای پخش شدن محلول کلرید سدیم در تمام نقاط آرد، اتاقک شستشو به آرامی تکان داده شد. از سوی دیگر مقداری محلول کلرید سدیم در مخزن دستگاه ریخته و دمای آن روی ۲۵ درجه سلسیوس تنظیم گردید. سپس اتاقک شستشو به دستگاه متصل و دستگاه روشن شد و عمل شستشو به مدت ۵ دقیقه صورت پذیرفت.
پس از آن لازم بود تا آب اضافی حذف و گلوتن مرطوب حاصله توزین گردد. به همین منظور پس از اتمام فرآیند شستشو،گلوتن مرطوب به وسیله پنس از داخل اتاقک شستشو برداشته و به دو قسمت تقریباً مساوی تقسیم شد. سپس گلوله های گلوتن بر روی صفحات مشبک سانتریفیوژ قرار داده و به آرامی فشار داده شد. در نهایت عمل سانتریفیوژ به مدت ۱ دقیقه انجام شده و پس از آن قطعات گلوتن با دقت ۰۱/۰ گرم توزین شد.
میزان گلوتن مرطوب (G wet) که بصورت کسر جرمی نمونه بر حسب درصد بیان می شود، از معادله ۳-۱ محاسبه شد که در آن m1، جرم گلوتن مرطوب بر حسب گرم می باشد.
(رابطه ۳-۱) G wet = m1 ×۱۰%
۳-۴-۲ اندازه گیری خاکستر
اندازه گیری خاکستر آرد مطابق با استاندارد AACC 09-07 انجام شد. در ابتدا بوته چینی های (کروزه) خشک و تمیز را به مدت یک ساعت در کوره ۵۵۰-۶۰۰ درجه سلسیوس قرار داده و در دسیکاتور خنک شد. سپس مقدار ۳ گرم نمونه آرد در آن وزن شده و بوته چینی ها روی شعله و زیر هود به آرامی حرارت داده شدند تا دود آن محو شود. بعد ظرف حاوی نمونه به مدت ۶ ساعت در کوره الکتریکی در ۵۵۰ تا ۶۰۰ درجه سلسیوس حرارت داده شد تا خاکستر روشنی تشکیل گردد. در نهایت ظرف را در دسیکاتور قرار داده و پس از خنک شدن، توزین گردید. درصد خاکستر موجود در نمونه آرد از طریق رابطه ۳-۲ محاسبه شد:
(رابطه ۳-۲) ۱۰۰ × = درصد خاکستر
۳-۴-۳ اندازه گیری رطوبت
اندازه گیری رطوبت آرد مطابق با استاندارد AACC 44-16 انجام شد. ابتدا ظروف نمونه به مدت ۳۰ دقیقه در آون ۱۳۰ درجه سلسیوس حرارت داده و پس از آن به دسیکاتور انتقال داده شد تا خنک گردد. سپس ظروف را به کمک انبرک در ترازو گذاشته و توزین گردید. بعد مقدار ۳ گرم آرد در آن ها وزن شد.
ظروف حاوی نمونه در آون ۱۳۰ درجه به مدت۹۰ دقیقه حرارت داده شد. سپس در دسیکاتور خنک شده و مجددا توزین صورت گرفت. اختلاف وزن حاصل معادل مقدار رطوبت موجود در نمونه آرد می باشد. به این ترتیب درصد رطوبت آرد توسط رابطه ۳-۳ محاسبه شد:
(رابطه ۳-۳) ۱۰۰ × = درصد رطوبت
۳-۴-۴ اندازه گیری pH آرد
اندازه گیری pH آرد مصرفی مطابق با روش استاندارد ملی ایران شماره ۳۷ انجام شد. برای این کار ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر به ۱۰ گرم نمونه آرد در ارلن ۵۰۰ میلی لیتری اضافه شد. پس از اختلاط به مخلوط ۱۰ دقیقه استراحت داده شد تا مخلوط دو فاز شود. سپس بدون صاف کردن، pH فاز بالایی به وسیله pH متر الکتریکی در ۳ تکرار ثبت و گزارش گردید.
۳-۵ اندازه گیری خصوصیات نان
۳-۵-۱ مراحل تهیه و پخت نان
فرمولاسیون تهیه نان شامل آرد گندم و آب به همراه نمک (۲ درصد)، مخمر نانوایی (۲ درصد) و شکر (۱ درصد) بود. قبل از انجام کار، درصد جذب آب آرد برای تولید خمیر با استفاده از دستگاه فارینوگراف معادل ۵/۵۸ درصد تعیین شد.
به منظور تهیه خمیر، ابتدا مقداری از آب مورد نیاز را در مخلوط کن با نمک و شکر مخلوط نموده، سپس در دمای ۳۵ درجه سلسیوس، مخمر به آن اضافه شد. سپس نمونه آرد به تدریج به مخلوط کن اضافه و با باقی مانده آب به آرامی و تا فرم گرفتن کامل خمیر مخلوط شد.
خمیر تهیه شده به مدت ۲ ساعت در دمای ۳۲ درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد تا عمل تخمیر آن به خوبی صورت پذیرد. سپس نمونه ها به صورت چانه های ۵۰ گرمی تقسیم شده و مجددا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۳۲ درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شدند تا عمل تخمیر کامل شود. بعد از آن نمونه ها را شکل داده و در تنور صنعتی با دمای ۲۰۰ درجه سلسیوس به مدت ۲۵ دقیقه قرار گرفتند. پس از عملیات پخت، نمونه های نان تهیه شده را خنک کرده ودر فیلم های پلی پروپیلن و با کمک دستگاه پرس حرارتی، بسته بندی شدند.
۳-۵-۲ اندازه گیری حجم نان
اندازه گیری حجم نان مطابق با استاندارد AACC 72-10 انجام شد. حجم نان با استفاده از روش جابجایی دانه کلزا اندازه گیری شد. به این صورت که در ابتدا نمونه نان در داخل محفظه دستگاه حجم سنج قرار داده شد. سپس اهرم مربوط به مخزن دستگاه فشار داده شد تا دانه های کلزا به داخل محفظه محتوی نمونه راه پیدا کنند. در نهایت حجم نان که متناسب با میزان حجم دانه های کلزای جابجا شده بود، با استفاده از گیج دستگاه اندازه گیری شد.
۳-۵-۳ نحوه آزمون بیاتی نان
اندازه گیری گلوتن مرطوب آرد مطابق با استاندارد AACC 74-09 انجام شد. آزمون بیاتی نان با توجه به سفتی اندازه گیری شده توسط دستگاه بافت سنج[۴۴] مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این منظور بعد از خنک شدن نان، نمونه از مرکز نان تهیه شد. با استفاده از پروب مربوطه با قطر ۲۱ میلی متر، آزمون فشار در سرعت نفوذ ۱۰ میلی متر بر دقیقه انجام شد. این آزمون در بازه های زمانی ۲۴، ۴۸، ۷۲، ۹۶ و ۱۲۰ ساعت پس از پخت انجام شد. میزان سفتی بافت نان معادل ماکزیمم نیروی به دست آمده بر حسب نیوتن طی اولین فشردگی است که به عنوان شاخصی برای بیاتی نان منظور می شود.
۳-۵-۴ آزمون های حسی
ارزیابی حسی نان های تهیه شده توسط گروه پانل و از طریق جمع آوری اطلاعات پرسشنامه ای مشتمل بر رنگ، عطر، طعم، ویژگی پوسته و بافت محصول بود. به همین منظور برای هر کدام از ویژگی های مورد بررسی، به صورت گزینه های خیلی خوب، خوب، متوسط، بد و خیلی بد نظرخواهی شده و اطلاعات برای تجزیه و تحلیل به داده های کمی از ۱ تا ۵ تبدیل شدند. در نهایت درجه مطلوبیت با در نظر گرفتن مجموع امتیازات برای نمونه ها، مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.